Колоночная хроматография

Область применения Оборудование Рекомендации Видеоурок 1 (окрашенные вещества) Видеоурок 2 (неокрашенные вещества)

Колоночная хроматография – способ препаративного разделения смесей жидких или твердых веществ, основанный на различном сродстве разделяемых веществ к неподвижной (сорбент) и подвижной (элюент) фазам. Как правило, чем лучше вещество сорбируется неподвижной фазой - тем медленнее вещество выходит с колонки.

Область применения

1. Разделение смесей жидких или твердых веществ, различающихся по R_f (или t_R). Пример: разделение смеси нескольких компонентов с разницей в Rf не менее ~0.15.
2. Отделение целевого вещества от не сорбирующихся примесей. Пример: Отделение целевого вещества от неорганических примесей или примесей с Rf ~0.

Оборудование

Типичный прибор для колоночной хроматографии приведен на рисунке:

Все что необходимо для проведения колоночной хроматографии можно посмотреть на фото:

Посмотреть

1. Элюент.
   • Требования к элюенту (см. также Подбор элюента и сорбента для тонкослойной (ТСХ) и колоночной (КХ) хроматографии).
     1. Выделяемые вещества не должны взаимодействовать с элюентом или разрушаться при его присутствии. Пример: гидролиз эпоксидов или ацеталей водой на силикагеле.
     2. Элюент может быть или индивидуальным растворителем или смесью нескольких растворителей. Растворители должны легко удаляться после выделения веществ (поэтому диметилсульфоксид (ДМСО) или диметилформамид (ДМФА) не подходят из-за высокой температуры кипения).
     3. Элюент подбирают таким образом, чтобы на тонкослойной хроматограмме смеси (желательно на том же сорбенте), Rf продуктов различался не менее 0.15, и пятна выходили с Rf не более 0.5-0.6 после одного прогона хроматограммы.
     4. Если под действием растворителей различной полярности (полярных (метанол, возможно с добавлением уксусной кислоты или триэтиламина) и неполярных (гексан, пентан)) вещество не сдвигается со старта или двигается с фронтом, следует перейти к другому сорбенту. Пример: R_f = 0, так ведут себя высоко полярные вещества (ионные жидкости, амины) на силикагеле; или неполярные вещества на сорбентах с обращенной фазой. Пример: R_f = 1, так ведут себя неполярные вещества на силикагеле; или высоко полярные вещества (ионные жидкости, амины) на сорбентах с обращенной фазой. Ряд растворителей по полярности см. здесь.
   • Добавление элюента. Элюент добавляется или непосредственно, или при помощи капельной (делительной) воронки. Важно! При проведении хроматографирования слой сорбента ни в коем случае не должен пересыхать, иначе может произойти его растрескивание, приводящее к снижению разделяющей способности.
     

     Посмотреть

     
2. Хроматографическая колонка и количество сорбента.
   Представляет собой стеклянную трубку, один из концов которой имеет пористую насадку или заткнут кусочком ваты, для того чтобы сорбент не высыпался. Длина колонки зависит от Rf разделяемых веществ. Чем меньше разница в Rf - тем длиннее колонка (слой сорбента). Пример: Для разделения 2-х веществ с разницей в Rf ~ 0.4 требуется колонка около 10 см. Ширина колонки зависит от количества (г) разделяемой смеси. Чем больше количество - тем шире колонка. Пример: Для разделения ~0.5 грамма смеси 2-х веществ с разницей в Rf ~ 0.4 требуется колонка около 2.5 см шириной.
   
   Посмотреть

   
3. Сорбент. Выбирается исходя из свойств разделяемой смеси.
   • Требования к сорбенту.
     1. Разделяемые вещества не должны разрушаться в присутствии сорбента. Пример: разделение и очистка ацеталей на силикагеле (у него кислая реакция) практически невозможна из-за их разрушения. В то время как на нейтральном Al₂O₃ их удается эффективно очистить.
        См. также как с помощью ТСХ определить разлагается ли вещество на данном сорбенте.
     2. Если под действием растворителей различной полярности (полярных (метанол, возможно с добавлением уксусной кислоты или триэтиламина) и неполярных (гексан, пентан)) вещество не сдвигается со старта или двигается с фронтом, следует перейти к другому сорбенту (от полярного сорбента к неполярному и наоборот). Пример 1: R_f = 0, так ведут себя высоко полярные вещества (ионные жидкости, амины) на силикагеле; или неполярные вещества на сорбентах с обращенной фазой. Пример 2: R_f = 1, так ведут себя неполярные вещества на силикагеле; или высоко полярные вещества (ионные жидкости, амины) на сорбентах с обращенной фазой.
4. Приемники фракций. Для сбора фракций можно использовать как обычные плоскодонные колбы (A), так и пробирки (Б). Когда разделяемые вещества окрашены, видно как они выходят с колонки. Каждое вещество собирают в отдельный приемник. Если вещества выходят смесью - смесь собирают отдельно. Если разделяемые вещества не окрашены, ведут сбор фракций определенного объема, который зависит от размеров колонки и от степени разделения веществ (R_f). Пример: Обычно при делении 0.2 г исходной смеси собирают по 7-10 мл фракций, при делении 2-3 г - по 20-25 мл. Собранные фракции анализируют при помощи тонкослойной хроматографии (ТСХ).
   

   Посмотреть

   
   

   А Б
   
5. Лапка. Колонку закрепляют на штативе при помощи лапки. Важно! Металлическая лапка НЕ должна соприкасаться со стеклом, для избежания растрескивания колбы при перегонке. Для этого между колбой и лапкой помещают резиновые прокладки.
   

   Посмотреть

   

Рекомендации при проведении

Современные методы колоночной хроматографии позволяют, пожалуй, разделять смеси любого состава. Для этого необходимо тщательно подобрать для каждого компонента смеси: элюент и сорбент.

1. Перед проведением колоночной хроматографии необходимо подобрать элюент и сорбент при помощи тонкослойной хроматографии (см. Подбор элюента и сорбента для тонкослойной (ТСХ) и колоночной (КХ) хроматографии). Для эффективной очистки выделяемого компонента смеси должно иметь значение Rf должно быть ~0.5. Примеси должны отличаться по Rf не менее, чем на 0.15.
2. Элюент для колоночной хроматографии должен быть менее полярным, чем для ТСХ анализа. Пример: если Rf выделяемого компонента смеси на ТСХ 0.5 в системе гексан/этилацетат (3:1), то для колоночной хроматографии следует использовать смесь 5:1. Ряд растворителей по полярности см. здесь.
3. Для эффективного разделения смеси нескольких веществ можно использовать градиентное элюирование, т.е. (на примере хроматографии на силикагеле), начинать элюировать неполярными растворителями (пентан, гексан), далее постепенно увеличивать полярность смеси (смеси: гексан/этилацетат от 20:1 до 1:5) и, наконец, переходить к высоко полярным растворителям и смесям (метанол, смеси метанол/триэтиламин 20:1).
4. Способы заполнения колонки сорбентом:
   1. Сухой способ. Колонка заполняется сорбентом. После чего сразу наносят вещество и приступают к элюированию. Большой минус этого способа - частое растрескивание слоя сорбента - из-за чего плохое разделение. Данный способ подходит для флеш-хроматографии, т.е. отделения целевого вещества от примесей с Rf ~0.
   2. Элюент затем сорбент. Колонку заполняют до половины длины элюентом, затем порциями засыпают сорбент, следя, чтобы он полностью смачивался. Минус этого способа - если сорбент достаточно мелкий, он слипается комками и падает на дно колонки в виде шариков. Способ часто применяют при работе с крупнозернистым силикагелем.
   3. Сорбент в виде суспензии в элюенте. В колонку засыпают необходимое количество сухого сорбента (чтобы определить необходимое количество), высыпают его из колонки в химический стакан. Заливают сорбент элюентом и перемешивают для равномерного смачивания. Через некоторое время суспензию взбалтывают и выливают при помощи химической воронки на колонку. Остатки сорбента смывают со стенок химического стакана элюентом.
5. Способы нанесения вещества на колонку:
   1. Сухой способ. Вещества наносятся в индивидуальном виде - твердом (просто насыпают на колонку) или жидком (переносят пипеткой на колонку).
   2. В растворе. Вещество растворяют в минимальном количестве элюента или менее полярном растворителе, чем элюент и наносят пипеткой. Важно! Растворитель должен быть менее полярный, чем элюент, иначе вещество вытянется с колонки вместе с этим растворителем. Важно! Чем уже слой раствора с веществом - тем лучше разделение.
   3. В виде твердой смеси с сорбентом. Вещество смешивают с сорбентом с добавлением небольшого количества растворителя. Растворитель удаляют на роторном испарителе. Сухой сорбент с веществом насыпают на колонку.
6. Наносить вещество на колонку (жидкое или в растворе) следует по стенкам колонки, чтобы не размывать слой сорбента. Важно! Чем ровнее нанесено вещество, тем лучше его разделение.
7. После нанесения вещества верхний слой сорбента на колонке можно накрыть ваткой или фильтровальной бумагой, чтобы при добавлении элюента не происходило размывание слоя сорбента. Важно! Чем ровнее слой сорбента, тем лучше разделение веществ.
8. Элюирование под давлением. В принципе, в большинстве случаев элюирование проводят при атмосферном давлении. Так как чем быстрее скорость элюирования - тем хуже разделение. Однако, при использовании мелкозернистых сорбентов без элюирования при избыточном давлении не обойтись из-за крайне низкой скорости процесса. В этих случаях применяют колбы Бунзена (А), в которые помещают хроматографические колонки и подключают к вакуумному насосу (наиболее подходит при проведении флеш-хроматографии на фильтре Шотта) или нагнетают давление при помощи груши (Б).
   

   Посмотреть

   А Б
9. Важно! При проведении хроматографирования слой сорбента ни в коем случае не должен пересыхать, иначе может произойти его растрескивание, приводящее к снижение разделяющей способности.
10. Вещество должно быть растворимо в применяемом элюенте, иначе произойдет его кристаллизация в колонке, что ухудшает разделение. Если кристаллизация все же произошла, можно:
    1. сменить элюент, на тот, который растворяет полученное вещество;
    2. в элюент добавить близкий по полярности растворитель, который растворяет полученное вещество;
    3. слегка нагреть слой сорбента, до температуры менее температуры кипения элюента.
    4. ничего не делать, возможно, вещество постепенно растворится в большом количестве элюента.