Колоночная хроматография

Область применения Оборудование Рекомендации Видеоурок 1 (окрашенные вещества) Видеоурок 2 (неокрашенные вещества)

Колоночная хроматография – способ препаративного разделения смесей жидких или твердых веществ, основанный на различном сродстве разделяемых веществ к неподвижной (сорбент) и подвижной (элюент) фазам. Как правило, чем лучше вещество сорбируется неподвижной фазой - тем медленнее вещество выходит с колонки.

Область применения

1. Разделение смесей жидких или твердых веществ, различающихся по R_f (или t_R). Пример: разделение смеси нескольких компонентов с разницей в Rf не менее ~0.15.
2. Отделение целевого вещества от не сорбирующихся примесей. Пример: Отделение целевого вещества от неорганических примесей или примесей с Rf ~0.

Оборудование

Типичный прибор для колоночной хроматографии приведен на рисунке:

Все что необходимо для проведения колоночной хроматографии можно посмотреть на фото:

Посмотреть

1. Элюент.
   • Требования к элюенту (см. также Подбор элюента и сорбента для тонкослойной (ТСХ) и колоночной (КХ) хроматографии).
     1. Выделяемые вещества не должны взаимодействовать с элюентом или разрушаться при его присутствии. Пример: гидролиз эпоксидов или ацеталей водой на силикагеле.
     2. Элюент может быть или индивидуальным растворителем или смесью нескольких растворителей. Растворители должны легко удаляться после выделения веществ (поэтому диметилсульфоксид (ДМСО) или диметилформамид (ДМФА) не подходят из-за высокой температуры кипения).
     3. Элюент подбирают таким образом, чтобы на тонкослойной хроматограмме смеси (желательно на том же сорбенте), Rf продуктов различался не менее 0.15, и пятна выходили с Rf не более 0.5-0.6 после одного прогона хроматограммы.
     4. Если под действием растворителей различной полярности (полярных (метанол, возможно с добавлением уксусной кислоты или триэтиламина) и неполярных (гексан, пентан)) вещество не сдвигается со старта или двигается с фронтом, следует перейти к другому сорбенту. Пример: R_f = 0, так ведут себя высоко полярные вещества (ионные жидкости, амины) на силикагеле; или неполярные вещества на сорбентах с обращенной фазой. Пример: R_f = 1, так ведут себя неполярные вещества на силикагеле; или высоко полярные вещества (ионные жидкости, амины) на сорбентах с обращенной фазой. Ряд растворителей по полярности см. здесь.
   • Добавление элюента. Элюент добавляется или непосредственно, или при помощи капельной (делительной) воронки. Важно! При проведении хроматографирования слой сорбента ни в коем случае не должен пересыхать, иначе может произойти его растрескивание, приводящее к снижению разделяющей способности.
     

     Посмотреть

     
2. Хроматографическая колонка и количество сорбента.
   Представляет собой стеклянную трубку, один из концов которой имеет пористую насадку или заткнут кусочком ваты, для того чтобы сорбент не высыпался. Длина колонки зависит от Rf разделяемых веществ. Чем меньше разница в Rf - тем длиннее колонка (слой сорбента). Пример: Для разделения 2-х веществ с разницей в Rf ~ 0.4 требуется колонка около 10 см. Ширина колонки зависит от количества (г) разделяемой смеси. Чем больше количество - тем шире колонка. Пример: Для разделения ~0.5 грамма смеси 2-х веществ с разницей в Rf ~ 0.4 требуется колонка около 2.5 см шириной.
   
   Посмотреть

   
3. Сорбент. Выбирается исходя из свойств разделяемой смеси.
   • Требования к сорбенту.
     1. Разделяемые вещества не должны разрушаться в присутствии сорбента. Пример: разделение и очистка ацеталей на силикагеле (у него кислая реакция) практически невозможна из-за их разрушения. В то время как на нейтральном Al₂O₃ их удается эффективно очистить.
        См. также как с помощью ТСХ определить разлагается ли вещество на данном сорбенте.
     2. Если под действием растворителей различной полярности (полярных (метанол, возможно с добавлением уксусной кислоты или триэтиламина) и неполярных (гексан, пентан)) вещество не сдвигается со старта или двигается с фронтом, следует перейти к другому сорбенту (от полярного сорбента к неполярному и наоборот). Пример 1: R_f = 0, так ведут себя высоко полярные вещества (ионные жидкости, амины) на силикагеле; или неполярные вещества на сорбентах с обращенной фазой. Пример 2: R_f = 1, так ведут себя неполярные вещества на силикагеле; или высоко полярные вещества (ионные жидкости, амины) на сорбентах с обращенной фазой.
4. Приемники фракций. Для сбора фракций можно использовать как обычные плоскодонные колбы (A), так и пробирки (Б). Когда разделяемые вещества окрашены, видно как они выходят с колонки. Каждое вещество собирают в отдельный приемник. Если вещества выходят смесью - смесь собирают отдельно. Если разделяемые вещества не окрашены, ведут сбор фракций определенного объема, который зависит от размеров колонки и от степени разделения веществ (R_f). Пример: Обычно при делении 0.2 г исходной смеси собирают по 7-10 мл фракций, при делении 2-3 г - по 20-25 мл. Собранные фракции анализируют при помощи тонкослойной хроматографии (ТСХ).
   

   Посмотреть

   
   

   А Б
   
5. Лапка. Колонку закрепляют на штативе при помощи лапки. Важно! Металлическая лапка НЕ должна соприкасаться со стеклом, для избежания растрескивания колбы при перегонке. Для этого между колбой и лапкой помещают резиновые прокладки.
   

   Посмотреть

   

Рекомендации при проведении

Современные методы колоночной хроматографии позволяют, пожалуй, разделять смеси любого состава. Для этого необходимо тщательно подобрать для каждого компонента смеси: элюент и сорбент.

1. Перед проведением колоночной хроматографии необходимо подобрать элюент и сорбент при помощи тонкослойной хроматографии (см. Подбор элюента и сорбента для тонкослойной (ТСХ) и колоночной (КХ) хроматографии). Для эффективной очистки выделяемого компонента смеси должно иметь значение Rf должно быть ~0.5. Примеси должны отличаться по Rf не менее, чем на 0.15.
2. Элюент для колоночной хроматографии должен быть менее полярным, чем для ТСХ анализа. Пример: если Rf выделяемого компонента смеси на ТСХ 0.5 в системе гексан/этилацетат (3:1), то для колоночной хроматографии следует использовать смесь 5:1. Ряд растворителей по полярности см. здесь.
3. Для эффективного разделения смеси нескольких веществ можно использовать градиентное элюирование, т.е. (на примере хроматографии на силикагеле), начинать элюировать неполярными растворителями (пентан, гексан), далее постепенно увеличивать полярность смеси (смеси: гексан/этилацетат от 20:1 до 1:5) и, наконец, переходить к высоко полярным растворителям и смесям (метанол, смеси метанол/триэтиламин 20:1).
4. Способы заполнения колонки сорбентом:
   1. Сухой способ. Колонка заполняется сорбентом. После чего сразу наносят вещество и приступают к элюированию. Большой минус этого способа - частое растрескивание слоя сорбента - из-за чего плохое разделение. Данный способ подходит для флеш-хроматографии, т.е. отделения целевого вещества от примесей с Rf ~0.
   2. Элюент затем сорбент. Колонку заполняют до половины длины элюентом, затем порциями засыпают сорбент, следя, чтобы он полностью смачивался. Минус этого способа - если сорбент достаточно мелкий, он слипается комками и падает на дно колонки в виде шариков. Способ часто применяют при работе с крупнозернистым силикагелем.
   3. Сорбент в виде суспензии в элюенте. В колонку засыпают необходимое количество сухого сорбента (чтобы определить необходимое количество), высыпают его из колонки в химический стакан. Заливают сорбент элюентом и перемешивают для равномерного смачивания. Через некоторое время суспензию взбалтывают и выливают при помощи химической воронки на колонку. Остатки сорбента смывают со стенок химического стакана элюентом.
5. Способы нанесения вещества на колонку:
   1. Сухой способ. Вещества наносятся в индивидуальном виде - твердом (просто насыпают на колонку) или жидком (переносят пипеткой на колонку).
   2. В растворе. Вещество растворяют в минимальном количестве элюента или менее полярном растворителе, чем элюент и наносят пипеткой. Важно! Растворитель должен быть менее полярный, чем элюент, иначе вещество вытянется с колонки вместе с этим растворителем. Важно! Чем уже слой раствора с веществом - тем лучше разделение.
   3. В виде твердой смеси с сорбентом. Вещество смешивают с сорбентом с добавлением небольшого количества растворителя. Растворитель удаляют на роторном испарителе. Сухой сорбент с веществом насыпают на колонку.
6. Наносить вещество на колонку (жидкое или в растворе) следует по стенкам колонки, чтобы не размывать слой сорбента. Важно! Чем ровнее нанесено вещество, тем лучше его разделение.
7. После нанесения вещества верхний слой сорбента на колонке можно накрыть ваткой или фильтровальной бумагой, чтобы при добавлении элюента не происходило размывание слоя сорбента. Важно! Чем ровнее слой сорбента, тем лучше разделение веществ.
8. Элюирование под давлением. В принципе, в большинстве случаев элюирование проводят при атмосферном давлении. Так как чем быстрее скорость элюирования - тем хуже разделение. Однако, при использовании мелкозернистых сорбентов без элюирования при избыточном давлении не обойтись из-за крайне низкой скорости процесса. В этих случаях применяют колбы Бунзена (А), в которые помещают хроматографические колонки и подключают к вакуумному насосу (наиболее подходит при проведении флеш-хроматографии на фильтре Шотта) или нагнетают давление при помощи груши (Б).
   

   Посмотреть

   А Б
9. Важно! При проведении хроматографирования слой сорбента ни в коем случае не должен пересыхать, иначе может произойти его растрескивание, приводящее к снижение разделяющей способности.
10. Вещество должно быть растворимо в применяемом элюенте, иначе произойдет его кристаллизация в колонке, что ухудшает разделение. Если кристаллизация все же произошла, можно:
    1. сменить элюент, на тот, который растворяет полученное вещество;
    2. в элюент добавить близкий по полярности растворитель, который растворяет полученное вещество;
    3. слегка нагреть слой сорбента, до температуры менее температуры кипения элюента.
    4. ничего не делать, возможно, вещество постепенно растворится в большом количестве элюента.

Тонкослойная хроматография

Область применения Оборудование Рекомендации Видеоурок

Тонкослойная хроматография – способ анализа (реже препаративного разделения) смесей жидких или твердых веществ, основанный на различном сродстве разделяемых веществ к неподвижной (сорбент) и подвижной (элюент) фазам. Как правило, чем лучше вещество сорбируется неподвижной фазой - тем медленнее вещество двигается по пластине. Тонкослойная хроматография чрезвычайно чувствительный метод, позволяет обнаруживать до ~0.5 масс.-% примесей.

Область применения

1. Анализ смесей жидких или твердых веществ, различающихся по R_f.
2. Анализ реакционных смесей, мониторинг протекания химических реакций.
3. Мониторинг проведения колоночной хроматографии и контроль чистоты отбираемых фракций.
4. Определение чистоты конечного продукта.

Оборудование

Типичный прибор для проведения ТСХ анализа приведен на рисунке:

1. Капилляр. Представляет собой стеклянную трубку с внутренним диаметром 0.3-1.0 мм, вытянутую в пламени(см. Видеоурок по вытягиванию капилляра, Важно! Оба конца капилляра должны быть открыты). Края капилляра должны быть ровными, чтобы не царапать слой сорбента и при легком прикосновении переносить раствор вещества на пластину. Важно! Чем уже капилляр, тем легче получить небольшое пятно вещества на пластине. В качестве капилляра также удобно использовать насадки для пипетмана (см. фото выше).
2. Ёмкость для ТСХ. Химический стакан с плоским дном, на дно которого наливается элюент слоем 4-6 мм. Для воспроизводимых результатов дно и стенки емкости выкладываются фильтровальной бумагой, которая пропитывается элюентом. Емкость закрывается крышкой (или чашкой Петри, часовым стеклом) для избежания испарения элюента.
3. Элюент.
   • Требования к элюенту (см. Подбор элюента и сорбента для тонкослойной (ТСХ) и колоночной (КХ) хроматографии).
     1. Выделяемые вещества не должны взаимодействовать с элюентом или разрушаться в его присутствии. Пример: гидролиз эпоксидов или ацеталей водой на силикагеле.
     2. Элюент может быть или индивидуальным растворителем или смесью нескольких растворителей. Растворители должны легко удаляться после проведения анализа (поэтому диметилсульфоксид (ДМСО) или диметилформамид (ДМФА) не подходят из-за высокой температуры кипения).
     3. Элюент подбирают таким образом, чтобы пятно целевого вещества выходило с Rf не более 0.5-0.6 после одного прогона хроматограммы и было хорошо дифференцировано от примесей (~0.1 R_f). Если на старте остались еще вещества (R_f = 0, "сидят на старте"), следует сменить элюент и проанализировать состав этой смеси. Иногда целевое вещество может "сидеть на старте".
     4. Если под действием растворителей различной полярности (полярных (метанол, возможно с добавлением уксусной кислоты или триэтиламина) и неполярных (гексан, пентан)) вещество не сдвигается со старта или двигается с фронтом, следует перейти к другому сорбенту.
        Пример: R_f = 0, так ведут себя высоко полярные вещества (ионные жидкости, амины) на силикагеле; или неполярные вещества на сорбентах с обращенной фазой.
        Пример: R_f = 1, так ведут себя неполярные вещества на силикагеле; или высоко полярные вещества (ионные жидкости, амины) на сорбентах с обращенной фазой. Ряд растворителей по полярности см. здесь.
   • Количество элюента. Элюент наливается в емкость до образования слоя 4-6 мм. Важно! Пластину погружают в элюент так, чтобы пятна веществ не соприкасались непосредственно с элюентом, иначе произойдет вымывание веществ в элюирующую смесь.
4. Сорбент. Выбирается исходя из свойств разделяемой смеси.
   • Требования к сорбенту.
     1. Разделяемые вещества не должны разрушаться в присутствии сорбента. Пример: разделение и очистка ацеталей на силикагеле (у него кислая реакция) практически невозможна из-за их разрушения. В то время как на нейтральном Al₂O₃ их удается эффективно разделить.
        См. также как с помощью ТСХ определить разлагается ли вещество на данном сорбенте.
     2. Если под действием растворителей различной полярности (полярных (метанол, возможно с добавлением уксусной кислоты или триэтиламина) и неполярных (гексан, пентан)) вещество не сдвигается со старта или двигается с фронтом, следует перейти к другому сорбенту (от полярного сорбента к неполярному и наоборот).
        Пример 1: R_f = 0, так ведут себя высоко полярные вещества (ионные жидкости, амины) на силикагеле; или неполярные вещества на сорбентах с обращенной фазой.
        Пример 2: R_f = 1, так ведут себя неполярные вещества на силикагеле; или высоко полярные вещества (ионные жидкости, амины) на сорбентах с обращенной фазой.
5. Пластина.
   1. Ширина пластины определяется: по 5 мм от краев пластины, и 4-6 мм расстояние между пятнами. Длина пластины: от 5 см (для хорошо разделяющихся веществ) до 10 см или более (для сложных смесей).
   2. Линия "старта" проводится карандашом на расстоянии 5-7 мм от нижнего края пластины, с этого же края отрезаются уголки (~2 мм) для того, чтобы фронт элюента шел по пластине ровным слоем.
   3. Вещество наносится на пластину в виде раствора с достаточно небольшой концентрацией (иначе возможна "перегрузка пластины", т.е. вещества будут выходить длинной растянутой линией, не разделяясь) при помощи капилляра. Диаметр пятен 3-5 мм. При мелких пятнах <2 мм вещество на пластине сильно концентрировано, в результате - плохое разделение. При больших пятная >6 мм - вещество сильно размывается при элюировании затрудняя дифференциацию пятен.
   4. При анализе фракций колоночной хроматографии. Пятна нумеруют. Если все фракции не помещаются на одну пластину, то последняя фракция с предыдущей пластины также наносится на текущую пластину - для сравнения.
      Пример: на 1 пластине наносят фракции с 1 по 10, на второй с 10 по 19, на третьей с 19 по 28 и т.д.
   5. Линия "финиша" проводится карандашом после окончания элюирования на расстоянии 3-5 мм от верхнего края пластины. Важно! Для воспроизводимых результатов фронт элюента не должен достигать края пластины.
      Типичную ТСХ пластину после проведения анализа и проявления пятен можно посмотреть ниже:
      Пример:

      Посмотреть

      
      

      
      
6. Обнаружение пятен.
   Большинство органических соединений не окрашены, т.о. не удается визуально определить положение пятен на пластине. Поэтому, после проведения ТСХ анализа требуется проявить пятна в ультрафиолетовом свете (УФ), йоде (I₂) или под действием специальных реагентов. Подробнее читайте в разделе Обнаружение веществ при тонкослойной (ТСХ) и колоночной (КХ) хроматографии.

Рекомендации при проведении

1. Если при помещении пластины в емкость фронт элюента пошел неровно, следует вынуть пластину, выровнять нижний край ножницами и поместить пластину в емкость снова.
2. Для воспроизводимых результатов элюент для каждого ТСХ анализа следует готовить заново. Так как растворители испаряются.
3. Для тщательного анализа смеси нескольких веществ можно использовать градиентное элюирование, т.е. (на примере хроматографии на силикагеле), начинать элюировать неполярными растворителями (пентан, гексан), далее постепенно увеличивать полярность смеси (смеси: гексан/этилацетат от 20:1 до 1:5) и, наконец, переходить к высоко полярным растворителям и смесям (метанол, смеси метанол/триэтиламин 20:1).

Подбор элюента и сорбента для тонкослойной (ТСХ) и колоночной (КХ) хроматографии
(Методика)

1. Подбор элюента для тонкослойной хроматографии (ТСХ).

Так как наиболее часто используются пластины с силикагелем в качестве сорбента разберем подбор элюента именно на них. Методика не отличается в случае окиси алюминия в качестве сорбента, и обратна в случае сорбентов с обращенной фазой.

Ключевым моментом при подборе растворителя является относительная полярность растворителей, которую можно посмотреть Здесь.

1. На несколько пластин длиной ~7 см и шириной ~1 см наносится раствор разделяемой смеси (приготовление ТСХ пластины см. Тонкослойная хроматография).
   

   Посмотреть результат

   

2. Подбор элюента начинают с наименее полярных растворителей, таких как н-гептан, н-гексан, н-пентан, циклогексан
   

   Посмотреть результат

   
3. Верхнее вещество с Rf = 0.2 уже можно выделить в индивидуальном виде колоночной хроматографией. Часть смеси осталось на старте, следует продолжить подбор элюента для анализа ее состава. Для этого следует использовать более полярные системы. Например, смеси н-гексан/этилацетат (от ~10:1 до ~5:1), бензол, толуол, хлороформ.
   

   Посмотреть результат

   
4. Теперь первое пятно выходит почти с фронтом растворителя. На колонке оно выйдет в 1 - 2-ой фракциях. Наиболее эффективно удастся очистить 2 вещество с Rf = 0.4. Вещества с Rf = ~0.15 скорее всего поделить не удастся. Вещество (или смесь, пока не ясно) "сидящее на старте" не выйдет с колонки. Так как часть исходной смеси все еще имеет Rf = 0 следует продолжить анализ. Переходим к более полярной смеси - н-гексан/этилацетат (от ~2:1 до чистого этилацетата), хлористый метилен
   

   Посмотреть результат

   
5. В выбранной смеси на колонке уже не удастся разделить первые 4 вещества, скорее всего, будут получены смеси 1+2 и 3+4, однако, возможно, удастся выделить 5 вещество (хотя, скорее, оно захватит часть от 3+4) и, скорее всего, удастся выделить 6 вещество. Однако, часть смеси еще на старте. Переходим к сильно полярным растворителям: метанол, метанол + добавка кислоты (уксусная) или основания (триэтиламин), изопропанол, этанол и т.п.
   

   Посмотреть результат

   
6. В выбранной смеси 1-5 вещества выходят с фронтом, 6 вещество уже не удастся выделить на колонке (оно выйдет вместе с 1-5 веществами), зато 7-е вещество удастся эффективно очистить. Так как на старте не осталось больше веществ - ТСХ анализ смеси практически окончен.
7. Иногда удается подобрать смесь растворителей для смеси веществ, которые не разделялись в другой смеси. Хотя полярность обоих смесей, близка. Для этого следует сравнивать элюенты резко отличные по составу. Пример: н-гексан/этилацетат (А) или смесь толуол/хлористый метилен (или хлороформ) (Б); метанол или этилацетат/триэтиламин и т.п.
   

   Посмотреть результат

   A Б
8. Иногда компонент смеси идет с фронтом элюента уже в неполярном гексане. Или не сдвигается со старта метанолом с добавкой триэтиламина. В этом случае для его очисти необходимо использовать другой сорбент (обращенная фаза, сефадекс и т.д.).

2. Определение устойчивости компонентов смеси на данном сорбенте в данном элюенте (двумерная тонкослойная хроматография).

1. На Пластину ТСХ (приготовление см. Тонкослойная хроматография) размерами 6 х 6 см в нижний левый край на расстоянии 5 мм от обоих краев наносят раствор вещества.
   

   Посмотреть результат

   
2. Пластину элюируют найденным в 1 пункте этой статьи элюентом.
   

   Посмотреть результат

   
3. Пластину высушивают при комнатной температуре в течении 10-20 минут.
4. Пластину элюируют расположив вниз тем левым боком вниз (в элюент).
   

   Посмотреть результат

   
   A Б
   
5. Высушивают пластину и проявляют.

Если количество пятен не отличается от количества пятен при одномерном (обычной) тонкослойном хроматографическом анализе, значит вещество стабильно в выбранной системе (все пятна располагаются вдоль диагонали пластины) (См. Вариант А на рисунке выше). Если появляются "лишние" пятна (лежат не на диагонали пластины) значит вещество не стабильно (См. Вариант Б на рисунке выше) и следует заменить или элюент (например, протонный на апротонный) или сорбент (кислый силикагель на нейтральную окись алюминия).